“Hatékony táplálékallergia modell kidolgozása és jellemzése barna norvég patkányokban”
Mar Abril-Gil, Alba Garcia-Just, Francisco J. Pérez-Cano, Àngels Franch, Margarida Castell
“Absztrakt
Az ételallergia (FA) egy adott élelmiszerrel való érintkezés által kiváltott egészségkárosító hatás. Jelenleg nincs optimális állatmodell az FA-ra az immunterápiák szűrésére vagy új élelmiszerek allergén hatásának vizsgálatára.
Célkitűzés
Jelen vizsgálat célja az FA hatékony és gyors modelljének kifejlesztése volt barna norvég patkányokon. Az FA biomarkereinek megállapítása érdekében patkányokban összehasonlítottuk az ebben a modellben kapott immunválaszt és az anafilaxiás sokkot a csak intraperitoneális immunizálással elért eredményekkel.

A patkányok intraperitoneális injekcióban kaptak ovalbumin (OVA) alumíniummal és Bordetella pertussisból származó toxinnal, majd 14 nappal később három héten át naponta szájon át OVA-t (FA csoport). A csak i.p. injekciót kapó patkányok egy csoportját (IP-csoport) is vizsgálták. A szérum anti-OVA IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b és IgA antitesteket a vizsgálat során végig számszerűsítették. Orális kihívást követően meghatározták a testhőmérsékletet, a bélpermeabilitást, a motoros aktivitást és a hízósejt-proteáz II (RMCP-II) szintjét. A vizsgálat végén számszerűsítették az anti-OVA bél-IgA-t, a lép citokintermelését, a Peyer-foltok és a mesenteriális nyirokcsomók limfocita-összetételét, valamint a vékonybélben a génexpressziót.
Eredmények
A szérum OVA-specifikus IgG1, IgG2a és IgG2b koncentrációi az i.p. immunizálással emelkedtek, de az orális OVA beadást követően erősen megnövekedtek. Az anti-OVA IgE kétszeresére emelkedett az orális OVA beadás első hetében. Az anafilaxia mind az IP-, mind az FA-csoportban csökkentette a testhőmérsékletet és a motoros aktivitást, míg a bélpermeabilitás nőtt. Érdekes módon az FA csoportban sokkal magasabb volt az RMCP II szérumfehérje és a bél mRNS expressziója.
Következtetések
Ezek az eredmények egyrészt az FA hatékony és viszonylag gyors modelljét mutatják, amelyet a specifikus antitesttiterek, másrészt az RMCP-II magas szintű termelődését és bélrendszeri génexpresszióját.
………..
Megbeszélés
A jelen tanulmány egy FA modell felállítását és jellemzését mutatja be BN patkányokon, beleértve az AR indukcióját, amelyet az allergénnel, OVA-val, alumíniummal és tBp-vel együtt végzett korábbi i.p. immunizálást, majd az ezt követő napi orális OVA beadást követően három héten keresztül végeztünk. Az FA specifikus biomarkereinek megállapítása érdekében összehasonlítottuk az ebben a modellben kapott antiallergén immunválaszt és az AR-t a csak i.p. immunizálással elértekkel.
Az allergia elleni küzdelemre szolgáló gyógyszerek, táplálkozási beavatkozások vagy immunterápiák szűrésére vagy új élelmiszerek allergén hatásának vizsgálatára számos FA patkánymodellt írtak le, köztük olyanokat, amelyek csak orális úton [30-32], olyanokat, amelyek csak i.p. úton, adjuváns nélkül [40,56] és olyanokat, amelyek kombinálják az i.p. és orális beadást [42]. Bár a BN patkányok az atópiás emberekhez hasonlóan magas IgE-reagálók, az orális szenzibilizációt adjuváns nélkül kiváltó kísérleti eljárások ezen a patkánytörzsön időigényesek, és nem mindig képesek reprodukálható és hatékony FA-modellt létrehozni [20,30,37-39]. Tény, hogy korábban teszteltünk egy olyan modellt BN patkányokon, amelyet csak orális úton adtunk be, és az eredmény az volt, hogy néhány állat szenzibilizálódott, és egyik sem termelt specifikus IgE-t [39]. Ezzel szemben más, többféle i.p. immunizálási protokollt alkalmazó, adjuvánssal vagy anélkül végzett vizsgálatok a specifikus IgE sikeres termelődéséről számoltak be [40,56,57]. Ezért alkalmaztunk itt az orális allergén beadását megelőzően alumíniummal és tBp-vel végzett i.p. immunizálást.
Ahogy korábbi tanulmányokban leírtuk [54], a BN patkányok OVA-val, alumíniummal és tBp-vel történő i.p. immunizálása az állatok 100%-ában specifikus antitestek szintézisét indukálja, különösen a patkányok Th2 immunválaszához kapcsolódó izotípusok, mint az IgE, IgG1 és IgG2a [18,36,58]. Az anti-OVA antitest profil, beleértve a specifikus IgE-t is, nem meglepő, és mind az alum adjuvánsnak, mind a tBp-nek tulajdonítható, amelyek kedveznek az IgE szintézisnek [59,60]. Érdekes módon, amikor két héttel később napi OVA-oldatot adtak szájon át, a specifikus antitestválasz megerősödött. Ez a mintázat a szérum IgG izotípusok esetében volt megfigyelhető, amelyek meredeken emelkedtek az orális adagolás első hetében, ami azt bizonyítja, hogy az antiOVA immunválasz gyorsan felerősödött az orális OVA adagolás hatására. Hasonlóképpen, az OVA-specifikus IgE antitestek közel kétszeresére emelkedtek az orális fecskendezés egy hete után, azonban, amikor hosszabb ideig tartó orális OVA-adagolásra került sor, az IgE szérumkoncentrációja csökkent, ugyanazt a mintát követve, mint azoknál, akik csak i.p. immunizálásban részesültek. Ezek az eredmények a szérum anti-OVA antitest kinetikára vonatkozóan megegyeznek a Golias és munkatársai [61] által az FA egérmodelljében két i.p. immunizálással (két hét különbséggel) és 14 nappal később kétnaponta történő orális etetéssel kapott eredményekkel. Ez utóbbi vizsgálat különösen azt találta, hogy a specifikus IgE-válasz már az OVA orális beadása előtt is jelen volt, a szájon át történő beadást követő első héten tetőzött, majd később csökkent. Ezért a specifikus IgE-re vonatkozó általános eredmények alapján azt lehet feltételezni, hogy csak a beadott allergén első adagjai felelősek az IgE-szintézis fokozódásáért, és ez a válasz idővel megszűnik. Összességében az anti-OVA antitestekre vonatkozó eredményekből arra lehetett következtetni, hogy egy hatékony FA-modell valósult meg, mivel az állatok 100%-ánál specifikus antitestek szintézisét eredményezte, és viszonylag gyors volt, mivel a legmagasabb specifikus IgE- és IgG-szintet egy héttel az orális allergén beadása után érték el, ami hamarabb történt, mint más, közölt modellekben [34,37].
Az itt javasolt FA-modell szérum és bélrendszeri anti-OVA IgA antitestek szintézisét eredményezte, ami nem volt tapasztalható, amikor csak i.p. immunizálást végeztek, így bizonyítva a bél-asszociált nyirokszövet stimulálását. Bár az intestinális IgA-ról úgy gondolják, hogy az orális antigének felvételének korlátozásával hozzájárul a bél homeosztázisához, és védő szerepet tulajdonítanak neki az orális szenzibilizációval szemben [62], az ételallergiában betöltött szerepe még mindig ellentmondásos. Humán FA esetében arról számoltak be, hogy a specifikus IgA2 szintje (izotípus, amely főként a nyálkahártya felszínén, például a bélben található) megnövekedett, amikor a gyermekek toleránsak lettek [63]. Más szerzők azonban arról számoltak be, hogy a megnövekedett specifikus IgA a későbbi FA-hoz társult [64], és úgy tűnik, hogy a szérum allergénspecifikus IgA nincs összefüggésben az ételtoleranciával [65]. Eredményeink alapján, bár az orális kihívást nagy dózisú orális OVA-val végeztük, az intestinális IgA antitestek védőhatása a FA csoportban nem volt megfigyelhető, mivel az AR mérése hasonló eredményeket adott mind a FA, mind az IP csoportban.
Az AR indukciót követően a FA modellre jellemző volt a szérum RMCP-II koncentrációjának nagymértékű emelkedése, ami ismét a bélhez kapcsolódó nyirokszövet stimulációját tükrözheti, mivel ez a proteáz az aktivált nyálkahártya hízósejtekre jellemző [66]. Emellett a hízósejtekből felszabaduló egyéb mediátorok vazodilatációt okoznak, és felelősek a testhőmérséklet csökkenéséért [67,68]. A csak OVA-val i.p. úton immunizált állatoknál és az i.p. úton és az azt követő orális OVA beadással immunizált állatoknál hasonló testhőmérséklet-csökkenés következett be az AR indukciót követően. Nem volt összefüggés a testhőmérséklet és a szérum RMCP-II koncentráció között, ami arra utal, hogy a bélnyálkahártyán lévő hízósejtektől eltérő egyéb hízósejtek is hozzájárulhatnak az AR által kiváltott hipotermiához. Másrészt az AR mind az IP-, mind az FA-csoportban a bélpermeabilitás növekedését okozta, ami az OVA-immunizációt követően megzavart bélbarriert tükrözi. Kimutatták, hogy az OVA ismételt orális beadása az RMCP-II felhalmozódását eredményezi a bélben, ami mind a vékonybélben, mind a vastagbélben megváltozott motoros válaszokat eredményez [69,70]. Mindazonáltal arról számoltak be, hogy az i.p. immunizálás a bélpermeabilitás nagyobb mértékű növekedését eredményezte, mint az adjuváns nélküli orális szenzibilizáció, és ezt az RMCP-II felszabadulásának tulajdonították, más mediátorok mellett, ami növelheti a paracelluláris úton történő felszívódást [31]. Az itt kapott eredmények alapján úgy tűnik, hogy az FA-t (i.p. és orális szenzibilizáció) kapott patkányok gyorsabban szívják fel a βLG-t, mint az IP csoport, mivel a szérumfehérje koncentrációja a βLG orális beadása után 30 perccel (60 perccel az AR indukció után) általában magasabb volt, és gyorsabban eltűnt. A 30 percnél korábbi mintagyűjtés megerősítheti ezt a felvetést, és fényt deríthet arra, hogy van-e különbség a bélpermeabilitásban, ha az OVA-t szájon át adják az i.p. immunizálás után. Az AR által kiváltott viselkedésbeli változásokat a motoros aktivitás csökkenésével számszerűsítettük, ahogyan azt egy korábbi vizsgálatban [45] végeztük, a klasszikus pontrendszerek használata helyett, amelyek a vizsgáló szubjektív validálását igénylik [71,72]. Az AR indukciót követő eredmények a mozgások egyértelmű csökkenését mutatták a bázishoz képest. A motoros aktivitás IP és FA csoportok közötti összehasonlításakor azonban megfigyelhető volt, hogy az AR által kiváltott motoros aktivitáscsökkenés mindkét csoportban hasonló volt. Ezért az AR indukció után kapott eredményekből arra lehetett következtetni, hogy csak az RMCP-II szérumkoncentrációja, amely az orális OVA hatására erősen megemelkedett, egyértelműen jelezte az FA modell kialakulását.
A bélpermeabilitással kapcsolatos további vizsgálatoknak kell irányulniuk az orális allergén beadása által kiváltott változások tisztázására ebben az FA-modellben. A testhőmérséklet és a motoros aktivitás csökkenése azonban nem különbözött az IP és FA patkányok között, ami a vizsgálat végén jelenlévő hasonló szérum IgE-szinteknek tulajdonítható.
Az AR indukció után két nappal nyert szövetminták lehetővé tették az FA folyamat részletes jellemzését az i.p. immunizációval összehasonlítva. A PP és az MLN limfocita-összetételének vizsgálata azt mutatja, hogy sem az i.p. immunizáció, sem az orális OVA-adagolás nem változtatta meg a fő limfocita-alcsoportok arányát ezekben a bélkompartmentekben, legalábbis abban az időpontban, amikor ezeket a mintákat vették. Ezek az eredmények nem egyeznek Ogawa és munkatársai [43] eredményeivel, akik a T-limfociták felhalmozódásáról számoltak be a PP-ben egy FA modellben. További, különböző időpontokban végzett vizsgálatok segíthetnek ennek az ellentmondásnak a tisztázásában, de az eredményeink alapján azt sugallhatjuk, hogy a PP-ben és az MLN-ben a limfociták fenotípusának jellemzése nem jelentette a FA indukció biomarkerét. Másrészt megfigyeltük, hogy a T-sejtek aránya megnőtt, amikor az IP csoportból izolált MLN limfocitákat in vitro specifikusan stimuláltuk, de az FA csoportban nem találtuk ezeket az eredményeket. Ezek az adatok arra utalhatnak, hogy az IP-csoportban a limfociták érzékenyek voltak, szemben a három héten át szájon át történő OVA-adagolás után tapasztalt limfocita-rezisztenciával. Ez a feltételezés összhangban van az OVA-val stimulált lépsejtekből kapott citokin eredményekkel, amelyek azt mutatják, hogy csak az IP csoportban volt magasabb a lépsejtekből felszabaduló IL-4 és IL-10 mennyisége, mint az RF csoportban megfigyelt, míg az FA csoportban a felszabaduló citokinek koncentrációja nem különbözött a referenciaértékektől. Ebben az értelemben, bár egyes szerzők leírják az IL-4 és IL-10 mennyiségének növekedését az FA állatok léptenyészeteinek felülúszójában [34,73,74], más szerzők nem [42], és egyikük sem hasonlítja össze az i.p. immunizálás önmagában és az i.p., valamint az orális allergén beadásával együtt végzett immunizálás közötti változásokat.
Ezekből az eredményekből arra lehet következtetni, hogy a három hétig tartó allergén beadás után gyűjtött lépsejtekből felszabaduló citokinek nem tükrözik az FA-ban jelenlévő orális szenzibilizációs folyamatot. Az FA indukció egy korábbi fázisában végzett vizsgálatok jobban reprezentálhatják ezt a választ. Ezenkívül a lépsejtek inkubálásának más körülményei, mint többek között a rövidebb stimuláció és a magasabb ingerületkoncentráció, jobb feltételek lehetnek a reprezentatív citokinek felszabadításához. Mindazonáltal feltételezhető, hogy a vizsgálat végén a folyamatos orális OVA-adagolás bizonyos toleranciát eredményezett. Ez a válasz hiánya nem tükröződne az antitestek nagyfokú szintézisében, amely a folyamat során végig fennállt, hanem csak a vizsgálat végén begyűjtött sejtek specifikus stimulációjában lenne megfigyelhető.
Végül, a bélszöveten történő génexpresszió vizsgálata tükrözhetné az orális OVA-adagolás által helyileg kiváltott változásokat. Azt találtuk, hogy az RMCP-II génexpressziója jelentősen megnövekedett az FA állatokban, és ezek az eredmények összhangban vannak e mediátor szérumkoncentrációjával, valamint az e molekula génexpressziójával kapcsolatban táplálékallergiás egerekben és patkányokban jelentett változásokkal is [33,35,43]. Meglepő módon azonban a FcεRI génexpressziója nem változott az FA indukcióval, bár az i.p. immunizálás után igen. Egér hízósejtek esetében arról számoltak be, hogy az FcεRI internalizációja az antigénspecifikus deszenzitizáció egyik mechanizmusa [75]. Ezért az IP és FA csoportokban az FcεRI génexpresszióban kapott eredmények összehasonlítása azt az elképzelést erősítheti, hogy az FA csoportban a folyamatos orális allergénadagolás hatására bizonyos tolerancia alakult ki.
Összefoglalva, az i.p. immunizálás és az azt követő élelmiszer-allergén orális beadása kombinációjával olyan patkánymodellt hoztunk létre az FA-ra, amely hatékony, mivel minden állatban képes volt specifikus Th2-hez kapcsolódó antitestek, különösen IgE szintézisét és ennek következtében AR-t indukálni az orális kihívást követően.
Ez a tény nagy előnyt jelent a kizárólag orális úton kiváltott FA-modellekkel szemben, amelyek nem minden kísérletben adtak hatékony és reprodukálható eredményeket. Ezenkívül az allergiás válasz kialakulása gyorsabb, mint más leírt FA modellekben, mivel egy héttel az allergén orális beadása után, azaz három héttel az i.p. immunizálás után magas specifikus IgE-szintek termelődtek. A csak i.p. immunizációval összehasonlítva a kifejlesztett modell sokkal magasabb szintű specifikus IgG antitesteket biztosít, patkányban nagy mennyiségű Th2-hez kapcsolódó antitestet (IgG1 és IgG2a), valamint anti-OVA IgE-t is elérve, bár az anafilaxiás válasz öt hét után mindkét csoportban hasonló volt. Ezenkívül az anafilaxia indukciója után felszabaduló RMCP-II szintje és e proteáz bélrendszeri génexpressziója az i.p. immunizáláshoz képest a legjobb biomarkerek az FA folyamatára. A lépből és a mesenteriális nyirokcsomókból származó limfociták in vitro antigénspecifikus aktiválásából származó eredmények e sejtek bizonyos fokú érzéketlenségi állapotára utalnak, amelyet valószínűleg az allergén ismételt orális dózisai idéznek elő. Mindazonáltal, bár további vizsgálatoknak kell megerősíteniük ezt a hipotézist, a specifikus antitestválasz kinetikája arra utal, hogy a legjobb FA-modell már egyhetes orális OVA-adagolás után is elérhető.”
További részletek a tanulmányban:
journals.plos.org
Development and Characterization of an Effective Food Allergy Model in Brown Norway Rats
Background Food allergy (FA) is an adverse health effect produced by the exposure to a given food. Currently, there is no optimal animal model of FA for the screening of immunotherapies or for testing the allergenicity of new foods. Objective The aim of the present study was to develop an effective....
Az összes reakció:
222 megosztás
Tetszik
Hozzászólás
Megosztás
Nincsenek megjegyzések:
Megjegyzés küldése